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關於HPLC的常見問題及解答


一、問:用HPLC進行分析時保留時間有時發生漂移，有時發生快速變化，原因何在？如何解決？
答:關於漂移問題：
1． 溫度控製不好，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定
2． 流動相發生變化，解決辦法是防止流動相發生蒸發、反應等
3． 柱子未平衡好，需對柱子進行更長時間的平衡
關於快速變化問題
1． 流速發生變化，解決辦法是重新設定流速，使之保持穩定
2． 泵中有氣泡，可通過排氣等操作將氣泡趕出。
3． 流動相不合適，解決辦法為改換流動相或使流動相在控製室內進行適當混合

二、問:液相色譜中峰出現拖尾或出現雙峰的原因是什麽？</B>
答: 1． 篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向衝洗柱子，替換篩板或更換柱子。
2． 存在幹擾峰，解決辦法為使用較長的柱子，改換流動相或更換選擇性好的柱子

三、問：HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法</B>
答: 1． 樣品量不足，解決辦法為增加樣品量
2． 樣品未從柱子中流出。可根據樣品的化學性質改變流動相或柱子
3． 樣品與檢測器不匹配。根據樣品化學性質調整波長或改換檢測器
4． 檢測器衰減太多。調整衰減即可。
5． 檢測器時間常數太大。解決辦法為降低時間參數
6． 檢測器池窗汙染。解決辦法為清洗池窗。
7． 檢測池中有氣泡。解決辦法為排氣。
8． 記錄儀測壓範圍不當。調整電壓範圍即可。
9． 流動相流量不合適。調整流速即可。
10． 檢測器與記錄儀超出校正曲線。解決辦法為檢查記錄儀與檢測器，重作校正曲線。

四、問：做HPLC分析時，柱壓不穩定，原因何在？如何解決？</B>
答：原因可能有：
1． 泵內有空氣，解決的辦法是清除泵內空氣，對溶劑進行脫氣處理；
2． 比例閥失效，更換比例閥即可；
3． 泵密封墊損壞，更換密封墊即可；
4． 溶劑中的氣泡，解決的辦法是對溶劑脫氣，必要時改變脫氣方法；
5． 係統檢漏，找出漏點，密封即可；
6． 梯度洗脫，這時壓力波動是正常的。

五、問：我購買的HPLC柱驗收測試時柱壓過高，請問為什麽？<
答：柱壓過高是HPLC柱用戶zui常碰到的問題。其原因有多方麵，而且常常並不是柱子本身的問題，您可按下麵步驟檢查問題的起因。
1． 拆去保護預柱，看柱壓是否還高，否則是保護柱的問題，若柱壓仍高，再檢查；
2． 把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查；
3． 將柱子的進出口反過來接在儀器上，用10倍柱體積的流動相衝洗柱子，（此時不要連接檢測器，以防固體顆粒進入流動池）。這時，如果柱壓仍不下降，再檢查；
4． 更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質，正是這些雜質將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請與廠商。 一般情況下，在進樣器與保護柱之間接一個在線過濾器便可避免柱壓過高的問題，SGE提供的Rheodyne 7315型過濾器就是解決這一問題的*選擇。

色譜柱
色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔負分離作用的色譜柱是色譜係統的心髒。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用於HPLC的各種微粒填料如多孔矽膠以及以矽膠為基質的鍵合相、氧化鋁、有機聚合物微球（包括離子交換樹脂）、多孔碳等，其粒度一般為3,5,7,10μm等，柱效理論值可達5~16萬/米。對於一般的分析隻需5000塔板數的柱效；對於同係物分析，隻要500即可；對於較難分離物質對則可采用高達2萬的柱子，因此一般10~30cm左右的柱長就能滿足複雜混合物分析的需要。
柱效受柱內外因素影響，為使色譜柱達到*效率，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結構（盡可能減少填充床以外的死體積）及裝填技術。即使的裝填技術，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏鬆，易產生溝流，流速較快，影響衝洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應。這種管壁區大約是從管壁向內算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜係統中，柱外效應對柱效的影響遠遠大於管壁效應。

1．柱的構造
色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。柱管多用不鏽鋼製成，壓力不高於70 kg/cm2 時，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應，不鏽鋼柱內壁多經過拋光。也有人在不鏽鋼柱內壁塗敷氟塑料以提高內壁的光潔度，其效果與拋光相同。還有使用熔融矽或玻璃襯裏的，用於細管柱。色譜柱兩端的柱接頭內裝有篩板，是燒結不鏽鋼或鈦合金，孔徑0.2~20µm（5~10µm），取決於填料粒度，目的是防止填料漏出。
色譜柱按用途可分為分析型和製備型兩類，尺寸規格也不同：①常規分析柱（常量柱），內徑2~5mm（常用4.6mm，國內有4mm和5mm），柱長10~30cm；②窄徑柱（narrow bore，又稱細管徑柱、半微柱semi-microcolumn），內徑1~2mm，柱長10~20cm；③毛細管柱（又稱微柱microcolumn），內徑0.2~0.5mm；④半製備柱，內徑＞5mm；⑤實驗室製備柱，內徑20~40mm，柱長10~30cm；⑥生產製備柱內徑可達幾十厘米。柱內徑一般是根據柱長、填料粒徑和折合流速來確定，目的是為了避免管壁效應。

2．柱的發展方向
因強調分析速度而發展出短柱，柱長3~10cm，填料粒徑2~3µm。為提高分析靈敏度，與質譜（MS）聯接，而發展出窄徑柱、毛細管柱和內徑小於0.2mm的微徑柱（microbore）。細管徑柱的優點是：①節省流動相；②靈敏度增加；③樣品量少；④能使用長柱達到高分離度；⑤容易控製柱溫；⑥易於實現LC-MS聯用。
但由於柱體積越來越小，柱外效應的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測器（甚至采用柱上檢測），更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設備應具備如下性能：輸液泵能精密輸出1~100µl/min的低流量，進樣閥能準確、重複地進樣微小體積的樣品。且因上樣量小，要求高靈敏度的檢測器，電化學檢測器和質譜儀在這方麵具有突出優點。

3．柱的填充和性能評價
色譜柱的性能除了與固定相性能有關外，還與填充技術有關。在正常條件下，填料粒度＞20µm時，幹法填充製備柱較為合適；顆粒＜20µm時，濕法填充較為理想。填充方法一般有4種：①高壓勻漿法，多用於分析柱和小規模製備柱的填充；②徑向加壓法，Waters；③軸向加壓法，主要用於裝填大直徑柱；④幹法。柱填充的技術性很強，大多數實驗室使用已填充好的商品柱。
必須指出，液相色譜柱的獲得，裝填技術是重要環節，但根本問題還在於填料本身性能的優劣，以及配套的色譜儀係統的的結構是否合理。
無論是自己裝填的還是購買的色譜柱，使用前都要對其性能進行考察，使用期間或放置一段時間後也要重新檢查。柱性能指標包括在一定實驗條件下（樣品、流動相、流速、溫度）下的柱壓、理論塔板高度和塔板數、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重複性，或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重複性在±5%或±10%以內。進行柱效比較時，還要注意柱外效應是否有變化。
一份合格的色譜柱評價報告應給出柱的基本參數，如柱長、內徑、填料的種類、粒度、色譜柱的柱效、不對稱度和柱壓降等。

4．柱的使用和維護注意事項
色譜柱的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護色譜柱。
①　避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會衝動柱內填料，因此在調節流速時應該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉動不能過緩（如前所述）。
②　應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變為全部是水，反之亦然。
③　一般說來色譜柱不能反衝，隻有生產者指明該柱可以反衝時，才可以反衝除去留在柱頭的雜質。否則反衝會迅速降低柱效。
④　選擇使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前麵連接一預柱，分析柱是鍵合矽膠時，預柱為矽膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被矽膠“飽和”，避免分析柱中的矽膠基質被溶解。
⑤　避免將基質複雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內，需要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應該經常更換。
⑥　經常用強溶劑衝洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質。在進行清洗時，對流路係統中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應是柱體積的20倍左右，即常規分析需要50~75ml。
下麵列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：矽膠柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次衝洗，然後再以相反順序依次衝洗，所有溶劑都必須嚴格脫水。甲醇能洗去殘留的強極性雜質，已烷使矽膠表麵重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次衝洗，再以相反順序依次衝洗。如果下一步分析用的流動相不含緩衝液，那麽可以省略zui後用水衝洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質，在甲醇（乙腈）衝洗時重複注射100~200µl四氫呋喃數次有助於除去強疏水性雜質。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂。有時也注射二甲亞碸數次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脫能除去蛋白質汙染。
陽離子交換柱可用稀酸緩衝液衝洗，陰離子交換柱可用稀堿緩衝液衝洗，除去交換性能強的鹽，然後用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表麵的有機物）、甲醇、水依次衝洗。
⑦　保存色譜柱時應將柱內充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發幹燥。禁止將緩衝溶液留在柱內靜置過夜或更長時間。
⑧　色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結濾片被堵塞，這時應更換濾片或將其取出進行清洗；另一種可能是大分子進入柱內，使柱頭被汙染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現塌陷，死體積增大。
在後兩種情況發生時，小心擰開柱接頭，用潔淨小鋼將柱頭填料取出1~2mm高度（注意把被汙染填料取淨）再把柱內填料整平。然後用適當溶劑濕潤的固定相（與柱內相同）填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理後柱效能得到改善，但是很難恢複到新柱的水平。
柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（5~30mm），可以起到保護、延長柱壽命的作用。采用保護柱會損失一定的柱效，這是值得的。
通常色譜柱壽命在正確使用時可達2年以上。以矽膠為基質的填料，隻能在pH2~9範圍內使用。柱子使用一段時間後，可能有一些吸附作用強的物質保留於柱頂，特別是一些有色物質更易看清被吸著在柱頂的填料上。新的色譜柱在使用一段時間後柱頂填料可能塌陷，使柱效下降，這時也可補加填料使柱效恢複。
每次工作完後，用洗脫能力強的洗脫液衝洗，例如ODS柱宜用甲醇衝洗至基線平衡。當采用鹽緩衝溶液作流動相時，使用完後應用無鹽流動相衝洗。含鹵族元素（氟、氯、溴）的化合物可能會腐蝕不鏽鋼管道，不宜長期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經常使用，應每隔4~5天開機衝洗15分鍾。